應(yīng)用簡介

本實驗重現(xiàn)了《食品中丙烯酰胺的測定》GB 5009.204-2014中首一法——穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS），樣品經(jīng)超純水提取，先后經(jīng)Cleanert® PEP和Cleanert® SAS固相萃取柱凈化，Venusil® MP C18色譜柱（2.1 × 150 mm，5 μm，100 Å）分離，0.1%的甲酸水溶液作為流動相洗脫，三重四級桿質(zhì)譜檢測，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明：當(dāng)丙烯酰胺的加標(biāo)量為2 mg/kg時，回收率在100% ~ 115%，可以滿足檢測要求。

丙烯酰胺（acylamide；CAS登記號79-06-1）是一種無色、無臭透明片狀晶體；可溶于水、醇、丙酮、醚和三氯甲烷，微溶于甲苯，不溶于苯和庚烷。相對分子質(zhì)量為71.08，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。丙烯酰胺是一種*的神經(jīng)毒素和準(zhǔn)致癌物，動物實驗和體外細(xì)胞實驗都證明丙烯酰胺還可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，早在2005年癌癥研究機構(gòu)就已將其列為2*致癌物質(zhì)。2002年4月，瑞典國家食品管理局發(fā)現(xiàn)許多含淀粉的食物經(jīng)過煎、烤、炸等高溫烹調(diào)后會產(chǎn)生高含量的丙烯酰胺。眾多研究表明薯條、薯片等土豆制品中丙烯酰胺的含量非常高，超過飲用水中允許大限度的500多倍。

因此通過有效的實驗技術(shù)手段，對食品中的丙烯酰胺進(jìn)行監(jiān)控，以確保消費者對食品消費的安全具有重要意義。

本實驗通過優(yōu)化前處理方法建立了丙烯酰胺在食品中的LC-MS/MS方法。

實驗部分

儀器、試劑與材料

主要儀器設(shè)備

AB SCIEX API 4000+液相質(zhì)譜聯(lián)用儀；

試劑材料

某品牌原味薯片、油條；甲酸、甲醇、正己烷皆為色譜純；屈臣氏水；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度 > 99%），用水溶；

D3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（CD2=CDCONH2）（濃度500 mg/L，溶劑乙腈）;80%甲醇水溶液：取20 mL水，加甲醇稀釋定容至100 mL；

0.1%甲酸溶液：移取100 μL甲酸并加入100 mL水，搖勻；一次性無菌注射器；尼龍針式過濾器(0.22 μm，直徑13 mm)；

Cleanert® PEP固相萃取柱：200 mg/6 mL；Cleanert® SAS固相萃取柱：200 mg/3 mL。

樣品制備

樣品提取

準(zhǔn)確稱取粉碎后的1 g樣品置于50 mL離心管中，加入200 μL D3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)（1 mg/L），再加入10 mL水，超聲振蕩30 min后，于8000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，漩渦萃取1 min，以6000 r/min的速度離心5 min，除去上層有機相，再用5 mL正己烷重復(fù)萃取一次，之后迅速取5 mL水相作為上樣液。

樣品凈化

Cleanert® PEP固相萃取柱（200 mg/6 mL）使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，將上述上樣液上Cleanert® PEP固相萃取柱，收集上樣液，并用4 mL 80%的甲醇水溶液洗脫，合并收集全部洗脫液，該洗脫液待用Cleanert®SAS固相萃取柱凈化；Cleanert®SAS固相萃取柱（200 mg/3 mL）依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，將上述洗脫液全部上樣，在重力作用下流出，收集全部流出液，并用2 mL甲醇洗脫，合并收集全部洗脫液。于40℃下氮吹濃縮至近干，用水定容至1 mL，待LC-MS/MS檢測。

注：上述操作步驟可在Qdaura®卓睿全自動固相萃取儀上完成。

色譜條件

液相條件

色譜柱：Venusil® MP C18，5 μm，100 Å，2.1 × 150 mm；

流動相： 0.1%甲酸水溶液；

柱  溫：26℃；

流  速：0.2 mL/min；

進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件

離子源：ESI+；電噴霧電壓：5500 V；霧化氣壓力：45 psi；氣簾氣壓力：10 psi；輔助氣壓力：45 psi；離子源溫度：330℃；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

表1. 丙烯酰胺質(zhì)譜參數(shù)

結(jié)果與討論

線性關(guān)系

分別配制濃度為0.01 mg/L、0.05 mg/ L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、3 mg/L的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)：0.1 mg/L），進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的丙烯酰胺進(jìn)樣濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以丙烯酰胺的峰面積與內(nèi)標(biāo)D3-丙烯酰胺的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，擬合參數(shù)如表2。

表2. 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

實驗結(jié)果

由表3可知，采用固相萃取結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測丙烯酰胺，內(nèi)標(biāo)法定量，丙烯酰胺的加標(biāo)回收率在100% ~ 115%之間，滿足檢測要求。

表3.丙烯酰胺加標(biāo)回收實驗結(jié)果(n=3)

結(jié)論

本實驗依據(jù)《食品中丙烯酰胺的測定》GB 5009.204-2014中首一法——穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法建立了食品中丙烯酰胺的檢測方法，并用內(nèi)標(biāo)法結(jié)合LC-MS/MS對食品中丙烯酰胺含量進(jìn)行了測定。當(dāng)加標(biāo)量為2.0 mg/kg時，回收率在100% ~ 115%之間，符合要求。

附：相關(guān)產(chǎn)品